荧光光谱法和磷光光谱法（三） 采用脉冲光源和门控检测装置

为了能在同时有荧光发射的荧光情况下测定磷光，通常是光谱光谱借助于荧光和磷光寿命的显著差异，或是法和法在荧光分光光度计上配置相应的磷光附件，采用脉冲光源和门控检测装置，磷光利用时间分辨技术进行测定。荧光图15.6是光谱光谱PE公司的LS 50B型发光光谱仪测定磷光的原理图。图15．7是法和法用于低温磷光测量时所使用的转筒式和转盘式磷光镜示意图。

四、磷光实验技术

1、荧光荧光偏振技术

在偏振光激发下，光谱光谱荧光体所发射的法和法荧光在空间不同取向强度不同。荧光偏振(p)和各向异性(r)的磷光定义如式(15.6)和式(15.7)，其值可按照图15.8测定，荧光只需在荧光分光光度计的光谱光谱激发和发射光路分别加上起偏器和检偏器(统称偏振附件)即可。

式中，法和法I_//(λ)和I (λ)分别是检偏器的取向平行或垂直于起偏器取向时在波长λ处观察到的荧光强度。荧光偏振测量示意图如图15.8所示。

荧光各向异性r与荧光体旋转相关时间θ和荧光寿命τ有关：

式中，r₀为非旋转状态下的荧光各向异性。溶液中，大多数荧光体的旋转速度很快，在50～100r/s(转每秒)以内，时间远远短于荧光体的激发态寿命。因此，通常情况下荧光各向异性值很小，基本为O。但当荧光分子连接到生物大分子或在高黏度介质中时，θ值很大，荧光各向异性变化很大。

荧光偏振和荧光各向异性不仅与荧光体分子形状、光选择性和荧光体吸光对偏振激发的取向等内在因素有关，而且与环境黏度等许多外界因素有关，在生物分子间的缔合反应、膜内微黏度、膜组成对膜相变的影响、蛋白质的衰变和转动速度等研究中应用广泛。利用荧光各向异性与分子转动速度有关这一特性，可用于荧光免疫分析。例如当小分子荧光体连接到大分子蛋白质或抗体之后，由于体积变大，分子转动速度变慢，偏振度、荧光各向异性增大。若样品中存在小分子抗原，则连接于抗体上的荧光体可能被抗原夺走，结果偏振度下降，从而可用于抗体或抗原测定。若采用脉冲偏振光激发荧光体，还可进行荧光偏振及各向异性的时间分辨测量。

2、时间分辨技术

时间分辨发光光谱技术是基于不同发光体的发光衰减速率不同的原理建立起来的一种荧光分析方法：

采用激光光源，通过固定延迟时间t_d和门控时间t_g，对发射单色器进行扫描，得到时间分辨发射光谱，从而实现对光谱重叠但发光寿命不同的组分进行分辨和分别测定；或是固定激发与发射波长，对门控时间扫描，得到发光强度随时间的衰减曲线，从而实现发光寿命的测量。时间分辨技术还能利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定。

参考资料：现代仪器分析实验与技术

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